Extraction ARN Totaux

EXTRACTION ARN TOTAUX

La préparation des ARN n’est pas effectuée par la plate-forme.

NB : La qualité de l’ARN est cruciale pour l’analyse de la lame
Toutes les opérations doivent être effectuées en conditions « Rnase-free » : gants, et toutes les solutions doivent être traitées en conséquence.

• Prélèvement des cellules :

  Suivant le tissu, la dissection se fait par des instruments de microchirugie ou par microlaser. Il est important de ne disséquer que les cellules d’intérêts et d’éviter au maximum les cellules à proximité. Après dissection, il est recommandé de transférer les morceaux de tissus à 4°C dans une solution de RNAlater RNA stabilization reagent (Ambion , QIAgen ou Sigma).

• Extraction d’ARN total :

  Suivant les modèles, des protocoles ont été mis au point au sein des laboratoires pour l’extraction des ARN totaux.
  Tissu : TRIzol (Invitrogen) est efficace pour la lyse des cellules. Théoriquement, le volume de l’échantillon ne doit pas dépasser 10 % du volume de TRIzol. Cependant pour éviter des problèmes de contamination d’ADN (pour les tissus comme la rate ou le foie), une quantité importante de TRIzol peut être utilisée (e.g. 500 μl de TRIzol pour 5 mg de tissu). Pour l’isolation des ARN totaux du chloroforme est ajouté. Puis les ARN totaux sont précipités par l’isopropanol.
  Cellules en culture : Kit Rneasy Total isolation (QIAgen)

• Traitement DNase :

il est préférable de traiter par DNase lorsque la quantité d’ARN le permet.

• Purification des ARN totaux :

Il est recommandé de précipiter par éthanol puis d’utiliser un kit de purification (RNeasy (QIAgen)) afin d’éviter toute contamination.
NB : Lors de la purification par éthanol, il est très important d’éliminer tout l’éthanol afin d’éviter des problèmes de bruit de fond.

• Quantité requise :

Quantité optimale d’ARN total ≥ 1 µg à une concentration ≥ 0,2 µg/µl

• Qualité des ARN :

 DO260/DO280 >=1,8
 DO260/DO230 >=2,0
 Absence de signe de dégradation sur gel d’agarose ou sur un profil du Bioanalyzer d’Agilent (ratio 28S/18S>= 1,6)

van Haaften et al. BMC Bioinformatics 2006

• Conditions d’envoi :

  En solution dans l’eau Rnase free ou de l’eau DEPC sur carboglace. Les tubes doivent être identifiés et accompagnés d’une fiche descriptive avec leur concentration et le volume total.